Методы флуоресентной детекции могут быть разделены на два главных направления: неспецифичные и специфичные. В таблице перечислены основные особенности, преимущества и недостатки наиболее используемых методов.
Неспецифичные методы
|
Принцип действия
|
Особенности
|
Интеркалирующие красители (SYBR Green I и др.)
|
Сигнал флуоресценции увеличивается из-за связывания интеркалирующего красителя с двухцепочечной ДНК.
|
Высокий уровень сигнала, общие подходы к дизайну различных экспериментов, возможны ложноположительные результаты из-за димеров праймеров или неспецифичных ампликонов, в силу этого эти методы непригодны для диагностических целей.
|
Амплифлуры (Amplifluor)
|
Аллель-специфичная ПЦР раскрывает шпилечную структуру флуоресцентно-меченных олигонуклеотидов.
|
|
Люкс-праймеры (Lux)
|
Сигнал флуоресценции меняется при включении флуоресцентно-меченного праймера в ПЦР продукт.
|
|
DzyNA-PCR
|
При связывании зонда с амплификатом образуется участок узнавания рестриктазы.
|
|
Cпецифичные методы
|
||
ТакМаны (TaqMan)
|
Краситель и гаситель разделяются из-за 5`-экзонуклеазной активности Taq-полимеразы.
|
Высокий уровень сигнала, легкость дизайна и синтеза, плохое соотношение сигнал/шум, проблемы с дискриминацией некоторых последовательностей.
|
Molecular Beacons
|
Краситель и гаситель разделяются после связывания зонда с ампликоном и раскрытия шпильки.
|
Низкий уровень сигнала из-за кинетики реакции, хорошое соотношение сигнал/шум.
|
Eclipse
|
Аналогичны ТакМанам, но устойчивы к экзонуклеазной активности полимеразы, сигнал генерируется после связывания зонда с ампликоном.
|
Высокий уровень сигнала, легкость дизайна и синтеза, плохое соотношение сигнал/шум, проблемы с дискриминацией некоторых последовательностей.
|
Hyb probes
|
Два красителя сближаются после связывания зондов с ампликоном, сигнал генерируется с помощью механизма FRET.
|
Плохое соотношение сигнал/шум, не подходит для всех приборов, реакция требует тримолекулярного взаимодействия.
|
Scorpions
|
Зонд-праймер включается в ПЦР продукт, сигнал генерируется после раскрытия шпильки и связывания свободного конца зонда с ампликоном.
|
Отличное соотношение сигнал/шум, мономолекулярная реакция, сравнительно дорогой синтез.
|
По материалам IVD Technology
Источник: Ген Эксперт